1.DamID

DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用檢測

DamID允許在活細胞中鑒定蛋白質(zhì)結(jié)合位點而無需交聯(lián)或免疫沉淀。它在2006年作為微陣列方法開發(fā)，然后才適應(yīng)NGS （Vogel等，2006）。

DamID涉及由DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（Dam）和感興趣的染色質(zhì)蛋白組成的融合蛋白的低水平表達。該融合蛋白靶向染色質(zhì)蛋白的天然結(jié)合位點，其中Dam甲基化周圍DNA中的腺嘌呤。隨后，分離甲基化的DNA片段，通過選擇性PCR擴增，并測序。

好處：

允許在活細胞中鑒定蛋白質(zhì)結(jié)合位點，而無需交聯(lián)或免疫沉淀

提供算法 （Li et al。，2015）

缺點：

可能有毒

模仿千字節(jié)大小的area

2.DNase I SIM

DNase I簡化植物的核 - 核方法

該方法是專門用于植物的簡化DNase I方案（Cumbie等，2015）。它包含在DNase I消化之前在Percoll梯度中進行細胞核純化的額外步驟，以更有效地去除細胞碎片和淀粉顆粒。使用T4 DNA聚合酶的DNA末端拋光步驟在DNA酶I消化后直接在細胞核中進行。這些額外的步驟消除了對凝膠純化及其伴隨的材料損失的需要。

好處：

不需要凝膠純化

缺點：

僅針對植物進行了優(yōu)化

3. MNase-SEQ /

微球菌核酸酶測序/微球菌核酸酶_輔助分離核小體/分離的核小體測序/分離的核小體測序

微球菌核酸酶（MNase）來源于金黃色葡萄球菌，其用于確定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的歷史可以追溯到1975年，當時該方法被稱為各種核葡萄球菌核酸酶或微球菌核酸酶消化細胞核或染色質(zhì) （Sollner-Webb et al。， 1975） （Axel等，1975）。隨著NGS的出現(xiàn)，MNase消化 （Schones等人，2008） 變得更加流行，并且終創(chuàng)造了術(shù)語MNase-Seq （Kuan等人，2009）。術(shù)語MNase輔助分離核小體測序（MAINE-seq） （Cusick等，1981） （Ponts等，2010），Nucleo-Seq （Valouev等，2011）和Nuc-seq （Chodavarapu等，2010） 不常用。與目的蛋白融合的MNase也已用于鈣依賴性切割以研究體內(nèi)特定的基因組基因座（ChEC-seq） （Zentner等，2015）。

在MNase-Seq中，用MNase處理gDNA。保護染色質(zhì)蛋白結(jié)合的序列免受MNase消化。接下來，提取來自DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的DNA并用于制備測序文庫。深度測序可準確表示基因組中調(diào)節(jié)DNA結(jié)合蛋白的位置 （Schones等，2008）

好處：

可以繪制核小體和其他DNA結(jié)合蛋白 （Zentner等，2012）

足跡亞核小體顆粒可保護低至約25 bp （Henikoff等，2011）

識別基因組中各種調(diào)節(jié)蛋白的位置

涵蓋廣泛的監(jiān)管網(wǎng)站

缺點：

MNase位點可能不占整個基因組

AT依賴性序列偏倚 （Kensche等，2016）

MNase與ChIP數(shù)據(jù)的整合對于鑒定和區(qū)分相似的蛋白質(zhì)結(jié)合位點是必要的

4.X-ChIP

高分辨率交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀測序

交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（X-ChIP）是染色質(zhì)研究的基礎(chǔ)技術(shù) （Breiling等，2001） （Negre等，2001）。隨著NGS的出現(xiàn)，這種簡單的技術(shù)，現(xiàn)在稱為X-ChIP-seq，能夠產(chǎn)生高分辨率的結(jié)果（Skene等，2015）。

該方法包括在室溫下用含1％甲醛的細胞中染色質(zhì)結(jié)合的DNA交聯(lián)10分鐘。洗滌細胞并重懸于裂解緩沖液中。在MNase消化后，通過短暫超聲處理使染色質(zhì)溶解，然后進行染色質(zhì)免疫沉淀。提取DNA，富集短片段，并用于制備測序文庫。

好處：

單基分辨率

缺點：

超聲處理可能引入序列偏差 （Teytelman et al。，2009）

無論持續(xù)時間如何，都能捕獲蛋白質(zhì)-DNA相互作用 （Zentner等，2015）

5.ORGANIC

從親和純化的天然分離的染色質(zhì)占據(jù)基因組的區(qū)域

有機物是一種溫和的方案，可避免交聯(lián)和超聲處理 （Kasinathan等，2014）。該方法是MNase-Seq和天然ChIP的組合，其提供復(fù)雜真核基因組中染色質(zhì)占據(jù)區(qū)域的圖譜。

好處：

避免超聲偏差 （Teytelman et al。，2009）

避免交聯(lián)偽影 （Zentner等，2014）

缺點：

蛋白質(zhì)的溶解性可能很差 （Zentner et al。，2014）

MNase序列偏倚 （Kensche等，2016）

細胞核隔離可能會引入偽影

其他實驗室沒有復(fù)制

6.CATCH-IT

共享附件標簽以捕獲組蛋白并識別營業(yè)額

CATCH-IT是一種測量全基因組核小體轉(zhuǎn)換動力學(xué)的直接方法 （Deal et al。，2010）。在該方法中，用甲硫氨酸替代物疊氮高丙氨酸（Aha）簡單處理細胞，其將生物素與含有新?lián)饺氲慕M蛋白的核小體偶聯(lián)。標記的染色質(zhì)用鏈霉抗生物素蛋白進行親和純化，嚴格洗滌以除去非組蛋白，并使用平鋪微陣列進行分析。

好處：

可以確定整個基因組中核小體轉(zhuǎn)換的差異

缺點：

潛在的人工制品

7.ChIP-Seq/HT-ChIP/ChIP-exo/Mint-ChIP

染色質(zhì)免疫沉淀測序/高通量ChIP /核酸外切酶修剪ChIP /多重ChIP

ChIP-Seq是一種成熟的方法來繪制特定的蛋白質(zhì)結(jié)合位點 （Solomon等，1988）。它產(chǎn)生了大量的衍生物，如AHT-ChIP-Seq （Aldridge等，2013），BisChIP-Seq （Statham等，2012），CAST-ChIP（Schauer等，2013）。，芯片BMS （Li等人。，2011），芯片BS-SEQ （Brinkman等人，2012），ChIPmentation （的Schmidl等人，2015） ，刪除片 （Rotem公司等人，2015） ，薄荷-ChIP （van Galen等，2016），PAT_ChIP （Fanelli等，2011），reChIP-seq （Truax等，2012），scChIP-seq（Rotem等，2015）和X-ChIP （Skene等，2014）。順序ChIP-seq（reChIP）也可以顯示染色質(zhì)上不同蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián) （Elsasser等，2015）。在該方法中，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在體內(nèi)交聯(lián)。接下來，將樣品片段化并用外切核酸酶處理以修剪未結(jié)合的寡核苷酸。蛋白質(zhì)特異性抗體用于免疫沉淀DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。提取，純化和測序DNA，得到蛋白質(zhì)結(jié)合位點的高分辨率序列。

好處：

蛋白質(zhì)結(jié)合位點的堿基對分辨率

可以繪制特定的調(diào)節(jié)因子或蛋白質(zhì)

外切核酸酶的使用消除了未結(jié)合DNA的污染 （Zentner等，2012）

缺點：

非特異性抗體可稀釋感興趣的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物庫

目標蛋白必須是已知的并且能夠產(chǎn)生抗體

8.HITS-FLIP

采用熒光配體相互作用分析的高通量測序

HiTS-FLIP是一種在的深度測量定量蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合親和力的技術(shù)。在該方法中，內(nèi)置于高通量測序儀中的光學(xué)器件用于可視化蛋白質(zhì)與流動細胞中測序的DNA的體外結(jié)合 （Nutiu等人，2011）。

通過合成對具有錨定的單鏈DNA的微流體流動細胞進行測序。剝離第二鏈DNA并使用Klenow聚合酶和未修飾的dNTP重建以形成雙鏈DNA簇。以不同濃度引入熒光標記的結(jié)合蛋白，并對結(jié)合進行成像。

好處：

量化和全面

缺點：

需要專門的硬件

尚未被科學(xué)界廣泛采用

9.Chem-seq

識別被小化學(xué)分子束縛的位點

Chem-seq可用于檢測小分子配體（如治療藥物）與基因組相關(guān)蛋白的結(jié)合。該信息可以提供關(guān)于小分子藥物對細胞功能的擾動的重要見解 （Anders等，2014）。

Chem-seq方法使用2種方法。在活細胞中，添加生物素化的藥物以允許藥物 - 靶標結(jié)合。將復(fù)合物與甲醛交聯(lián)，將細胞裂解并超聲處理，并將復(fù)合物捕獲在鏈霉抗生物素蛋白珠上。將富集的DNA片段純化并測序。對于體外分析，將生物素化的藥物加入細胞提取物中，并按照體內(nèi)方法進行剩余的步驟。

好處：

可應(yīng)用于生命，人體細胞

缺點：

創(chuàng)建生物素衍生物可能會改變藥物活性

10.FAIRE-seq/Sono-Seq

甲醛輔助分離調(diào)節(jié)元件/交聯(lián)染色質(zhì)的超聲處理

FAIRE-seq （Giresi等，2009） （Hogan等，2006） 和Sono-Seq （Auerbach等，2009） 基于DNA和核小體或序列特異性DNA結(jié)合蛋白之間交聯(lián)效率的差異。 。在該方法中，使用甲醛在體內(nèi)簡單地交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后將樣品裂解并超聲處理。苯酚提取后，純化水相中的DNA并測序。測序提供了未被組蛋白占據(jù)的DNA區(qū)域的信息。

好處：

簡單且高度可重復(fù)的協(xié)議

不需要抗體

不需要酶，如DNase或MNase，避免酶處理所需的優(yōu)化和額外步驟

不需要單細胞懸液或核分離，因此很容易適用于組織樣本 （Simon et al。，2012）

缺點：

無法識別與DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白

DNase-Seq可能更好地鑒定高表達基因的核小體缺失啟動子 （Song et al。，2011）

11. ATAC-SEQ

轉(zhuǎn)座酶 - 可及的染色質(zhì)測序/ ATAC-seq的測定針對血細胞進行了優(yōu)化

ATAC-Seq使用Tn5轉(zhuǎn)座體檢測基因組的無核小體區(qū)域 （Buenrostro等，2013）。該方法是常用的，并且優(yōu)化的方案可用于組織，例如血液（Fast-ATAC） （Corces等人，2016），神經(jīng)元 （Milani等人，2016），生物樣本標本 （Scharer等人，2016）。 ）和單細胞（scATAC-seq （Buenrostro等，2015）和單細胞ATAC-seq （Cusanovich等，2015））。

在該方法中，將gDNA與Tn5轉(zhuǎn)座體一起溫育，其在開放的染色質(zhì)區(qū)域中將其片段化并同時添加銜接子。純化區(qū)域的深度測序提供了基因組中無核小體區(qū)域的堿基對分辨率。

好處：

兩步方案，無適配子連接步驟，凝膠純化或交聯(lián)反轉(zhuǎn)

與FAIRE-Seq相比，信噪比高

缺點：

在機械樣品處理過程中，結(jié)合的染色質(zhì)區(qū)域可能會打開并被轉(zhuǎn)座組標記

只有一半的分子含有PCR擴增所需方向的銜接子

適配子位點之間的距離可能不是PCR擴增的選擇 （Sos et al。，2016）

12.CHIA-PET

配對末端標簽測序的染色質(zhì)相互作用分析

ChIA-PET具有免疫沉淀步驟以繪制長程DNA相互作用，類似于Hi-C （Li等人，2010） （Fullwood等人，2009）。在該方法中，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物被交聯(lián)和片段化。特異性抗體用于免疫沉淀目的蛋白質(zhì)。將具有*條形碼的兩組接頭以分開的等分試樣連接到DNA片段的末端，然后基于接近度自連接。沉淀DNA等分試樣，用限制酶消化，并測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。Hi-C和ChIA-PET目前在人類基因組中提供較好的分辨率平衡和合理的覆蓋率，以繪制遠距離相互作用（Dekker等，2013）。

Tang等人（Tang等人，2015）發(fā)表了一種改進的方案，稱為或長讀取ChIA-PET 。該方法用2個半接頭和單個生物素化的接頭連接取代2個單獨的連接反應(yīng)。接下來，將去交聯(lián)的純化的DNA片段化，并使用Tn5轉(zhuǎn)座酶在一個步驟中連接銜接子。后，對DNA進行PCR擴增和測序 （Sati et al。，2016）

好處：

適用于檢測大量長程和短程染色質(zhì)相互作用 （Sajan等，2012）

研究特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的相互作用

公共ChIA-PET數(shù)據(jù)集可通過ENCODE項目獲得 （Consortium等，2011）

去除傳統(tǒng)ChIP分析過程中產(chǎn)生的背景

免疫沉淀步驟降低了數(shù)據(jù)復(fù)雜性

缺點：

需要大量原料，通常至少1億個細胞 （Mumbach等，2016）

非特異性抗體可以降低不需要的蛋白質(zhì)復(fù)合物并污染池

連接子可以自我連接，產(chǎn)生關(guān)于真正DNA相互作用的模糊性

靈敏度有限; 可以檢測到少至10％的相互作用

13.3-C

染色質(zhì)構(gòu)象捕獲測序

3C-Seq （Duan等人，2012），Capture-C和Hi-C （Lieberman-Aiden等人，2009） 包括用于分析染色質(zhì)相互作用的一系列方法。Capture-C使用磁珠將生物素化片段的額外下拉添加到3C方法中。可以使用Capture-C方法（NG Capture-C）的新改進 （Davies等，2016）。Hi-C方法將3C-Seq擴展到全基因組染色質(zhì)接觸圖，并且它也已應(yīng)用于原位染色質(zhì)相互作用的研究（Sati等，2016） （Rao等，2014）。

在該方法中，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與甲醛交聯(lián)。將樣品片段化，并用限制酶提取，連接和消化DNA。對得到的DNA片段進行PCR擴增和測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。

好處：

允許檢測遠距離DNA相互作用

高通量方法

缺點：

檢測可能是由隨機染色體碰撞引起的

不到1％的DNA片段實際上產(chǎn)生了連接產(chǎn)物 （Bourgo等，2016）

由于多個步驟，該方法需要大量的起始材料

14.4C-seq

圓形染色質(zhì)構(gòu)象捕獲

4C （Zhao等人，2006），（Simonis等人，2006），也稱為4C-seq，是類似于3C的方法，有時稱為圓形3C。它允許無偏見地檢測與特定感興趣區(qū)域相互作用的所有基因組區(qū)域（Sajan等，2012）。在該方法中，使用甲醛交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。將樣品破碎，連接并消化DNA。得到的DNA片段自我環(huán)化，然后進行反向PCR和測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。

好處：

評估各個基因組位點的DNA接觸譜的優(yōu)選策略

高度可重復(fù)的數(shù)據(jù)

缺點：

將錯過感興趣區(qū)域的本地交互（<50 kb）

大圓圈不能有效放大

15.5C

染色質(zhì)構(gòu)象捕獲碳復(fù)制

5C （Dostie等人，2007） 允許同時確定多個序列之間的相互作用，并且是3C的高通量版本 （Sajan等人，2012）。在該方法中，使用甲醛交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。將樣品片段化并連接DNA并用限制酶消化。使用連接介導(dǎo)的PCR擴增得到的DNA片段并測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。

好處：

與4C不同，5C為許多對站點提供了交互頻率矩陣 （de Wit et al。，2012）

可用于重建較大基因組區(qū)域的（平均）3D構(gòu)象

缺點：

需要監(jiān)管站點的先驗信息 （Sati et al。，2016）

檢測可能不一定意味著由隨機染色體碰撞引起的相互作用

無法擴展到需要大量引物的全基因組研究

16.PB_seq

蛋白質(zhì)/ DNA結(jié)合后跟隨高通量測序

PB_seq是一種DNA結(jié)合分析，可以在沒有染色質(zhì)的情況下在全基因組范圍內(nèi)表征DNA蛋白結(jié)合能量景觀 （Guertin等，2012）。它屬于通常通過指數(shù)富集（SELEX）系統(tǒng)進化配體的方法家族 （Ozer等，2014）。對基因組DNA進行超聲處理，大小選擇和純化。在與DNA結(jié)合蛋白雜交后，分離，提取蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA并制備用于測序。

好處：

確定與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)無關(guān)的結(jié)合效率

缺點：

尚未被科學(xué)界廣泛采用

17.Pu-seq

聚合酶使用測序

Pu-seq提供直接的復(fù)制起源位置和效率數(shù)據(jù)，以及復(fù)制時間的間接估計 （Daigaku等，2015）。

含有雙鏈核糖核苷酸的DNA的堿處理導(dǎo)致磷酸骨架對核糖的裂解3'，產(chǎn)生5'羥基末端。如果變性DNA用作隨機六聚體引物延伸的模板，則5ê至3ê合成導(dǎo)致鄰近初始核糖的齊平末端。通過從單鏈DNA產(chǎn)生文庫并在每個末端放置不同的索引引物，可以將測序讀數(shù)定位到單個鏈，以確定具有單堿基準確度的原始核糖核苷酸位置。

好處：

單基準確度

缺點：

僅適用于酵母

18.SELEX or SELEX-seq / HT-SELEX

通過指數(shù)富集的指數(shù)富集/高通量配體系統(tǒng)演化的配體的系統(tǒng)演化

自1990年3個獨立小組描述次SELEX實驗時 （Ellington等，1990） （Tuerk等，1990）（Sullenger等，1990），該方法適用于廣泛的范圍技術(shù) （Chen et al。，2016） （Takahashi et al。，2016）。為NGS開發(fā)了一種高度多路復(fù)用的并行HT-SELEX方法 （Jolma等，2010）。SELEX-seq的變體 （Slattery等，2011） 使用Nextera銜接子序列進行有效的文庫制備 （Zhang等，2016）。

在該方法中，蛋白質(zhì)表達為與pD40htSELEX表達載體中與高斯熒光素酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合肽（SBP）的融合體。每個DNA配體含有14bp隨機區(qū)域（14N）和5bp條形碼，其單一地識別單個SELEX樣品。部分嵌套的引物用于連續(xù)的SELEX輪次。將含有所有可能的14bp序列的雙鏈DNA混合物與固定在96孔板的孔中的DNA結(jié)合蛋白一起溫育，導(dǎo)致DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合。洗滌和洗脫后，通過PCR擴增得到的更具特異性序列的群體并測序 （Caroli等，2016）

好處：

高通量和率

軟件管道可用 （Hoinka等，2016）（Caroli等，2016）

缺點：

可能包含序列偏差

19.HITS-FLIP

采用熒光配體相互作用分析的高通量測序

HiTS-FLIP是一種在的深度測量定量蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合親和力的技術(shù)。在該方法中，內(nèi)置于高通量測序儀中的光學(xué)器件用于可視化蛋白質(zhì)與流動細胞中測序的DNA的體外結(jié)合 （Nutiu等人，2011）。

通過合成對具有錨定的單鏈DNA的微流體流動細胞進行測序。剝離第二鏈DNA并使用Klenow聚合酶和未修飾的dNTP重建以形成雙鏈DNA簇。以不同濃度引入熒光標記的結(jié)合蛋白，并對結(jié)合進行成像。

好處：

量化和全面

缺點：

需要專門的硬件

尚未被科學(xué)界廣泛采用